引言

靶向蛋白质降解是一种新兴策略，旨在为治疗目的从细胞中选择性地去除特定蛋白质。尽管最初的研究主要集中在PROTAC分子，但如今，新的靶向降解方法层出不穷。其中之一是降解TAG（dTAG）技术。dTAG作为一种创新的靶标验证工具，类似于PROTACs，它利用一种异双功能小分子，构建目标蛋白与E3泛素连接酶之间的三元复合物。但dTAG技术的独特之处在于，通过CRISPR/Cas9技术将双功能降解剂的一部分结合位点引入目标蛋白，使其成为进行靶标验证和探讨剂量依赖效应的理想工具。

在本研究中，dTAG蛋白降解的分析采用双荧光素酶报告系统，以便测量靶蛋白的降解情况。具体而言，使用萤火虫荧光素酶作为基准标记物，其应不受到dTAG降解的影响。而目标蛋白与以非活性形式存在的纳米荧光素酶（HiBiT）融合。当dTAG降解剂通过引入的dTAG结合基序，将靶蛋白与E3泛素连接酶结合后，会形成三元复合物，从而导致靶蛋白及其融合的HiBiT片段的泛素化和降解。

为了测量纳米荧光素酶的荧光发射，降解后向系统中添加LgBiT，这一小型纳米荧光素酶片段能与未降解的HiBiT片段结合，从而形成活性纳米荧光素酶，出现荧光信号。纳米荧光素酶与萤火虫荧光素酶的发射比值则可作为dTAG降解剂效能的指示，比例越低，目标的降解程度越高。

研究目标

本研究旨在通过对dTAG结构进行优化，改进已知dTAG支架的动力学参数。研究人员将dTAG降解剂或DMSO对照液分配到1536孔iSTAR微孔板的孔中。通过将稳定转染的pSBTK-HiBiT-dTAG-TargetX-P2A-Fluc-T2A-Puro质粒的HEK293细胞单层从培养瓶中分离，制备成细胞悬液。经过1400rpm离心4分钟后，去除上清液，并将细胞沉淀重悬于含有2%胎牛血清的OPTIMEM培养基中。每孔加入25µL的细胞悬液，微孔板短暂离心后，在5% CO2、37°C环境下孵育4小时。最后，加入25µL OneGlo试剂，经过10分钟孵育与300rpm震荡后，使用PHERAstarFSX读取萤火虫荧光素酶的发射。

接下来，每孔加入25µL StopGlo试剂、0.025µL纳米荧光素酶底物与1/100 LgBiT，经过1分钟离心后，再次使用PHERAstarFSX读取纳米荧光素酶的化学发光结果。

dTAG分解酶的评估测试了不同dTAG降解剂对HiBiT靶标降解能力的影响。为了实现这一目标，将dTAG-v2、dTAG-47和dTAG-13以递增浓度（0.1至10,000 nM）加入表达HiBiT的细胞中，并使用1536孔酶标仪进行测量。所有测试的dTAG降解剂均显示出浓度依赖性地减少了纳米荧光素酶的发射量（即HiBiT的降解）。然而，不同的dTAG分子在HiBiT降解的程度上表现不一。dTAG-13引起约50%的降解，而dTAG-v1则展现出最强的降解效果，几乎完全降低了HiBiT。

在后续实验中，进一步评估了dTAG-v1降解剂的数据信号稳定性。评估中涵盖1至10µM浓度范围的dTAG-v1，并进行了32次重复实验，用DMSO处理的细胞作为空白对照组。结果显示，与DMSO对照相比，所有三种浓度的dTAG-v1均成功诱导HiBiT融合蛋白的降解，同时Z因子在0.84至0.87之间，表明数据的稳定性良好。

结论

通过使用dTAG蛋白质降解检测，本研究所测试的dTAG分子成功诱导了HiBiT融合蛋白质复合物的靶向降解。由于其高灵敏度、快速读取时间和优越的兼容性，PHERAstarFSX设备非常适合此类应用，结合iSTAR板的使用，其性能与其他类似的酶标仪相当。

感谢尊龙凯时在本研究过程中的支持，期待进一步推动靶向蛋白质降解技术的发展。