取过夜菌至50毫升离心管内，5000g离心1分钟以收集细菌沉淀，弃上清。再重复一次，每个离心管共收集100毫升的过夜菌沉淀。通常情况下，大肠杆菌需在LB培养基中培养约16小时，直至OD值达到2-4。建议在室温下以5000g（通常约为5000rpm）进行离心1分钟。若沉淀不充分，可适当延长离心时间，避免长时间或高速度离心导致沉淀过于紧密，影响后续的溶液I加入和沉淀的重悬。在离心管内直接倒掉上清液后，再加入约50毫升菌液并重复上述操作，最后将离心管倒置于吸水纸上，以便彻底排除液体。如果细菌密度较低，可考虑使用更多的菌液，再重复上述操作1-2次。高拷贝质粒时，每管的菌量一般不超过150毫升，而低拷贝质粒则不宜超过200毫升，过多的细菌会影响后续的裂解效果。

每管加入5毫升溶液I，重悬细菌沉淀，确保沉淀彻底散开且无可见的细菌团块。请确认溶液I中添加了RNaseA。使用vortex以最高速度混合10-20秒，悬起沉淀。需确保充分混匀，通过观察液体是否均匀，无明显细菌团块或絮状物。如果没有vortex设备，可使用移液枪轻轻击打沉淀，帮助其逐渐散开。

接着，每管加入5毫升溶液II，轻轻颠倒离心管4-6次，让其在室温下静置1-2分钟，以确保细菌完全裂解，并让液体变得透明。切记，不可使用vortex等剧烈方式操作，以免造成基因组DNA的断裂，从而污染最终得到的质粒。在颠倒4-6次后，液体应呈透明，而无团块或絮状物。如细菌未能完全散开，建议增加颠倒次数3-5次，但总裂解时间不得超过5分钟。

然后，每管加入7毫升溶液III，并迅速颠倒离心管4-6次以混匀，此时可见白色的絮状物形成。切勿vortex，颠倒次数应适中，以防最终获得质粒的质量下降。接下来，进行12,000-14,000rpm离心10分钟，若离心机的最高速度较低，应适当延长离心时间，例如5000-6000rpm下需离心20-30分钟直至沉淀充分。在离心的同时，准备好质粒纯化柱及自制漏斗，并在纯化柱上做好标记。

将上一步骤离心后的上清倒入或吸入质粒纯化柱内，并以12,000-14,000rpm离心2分钟，随后倒弃收集管内的液体。质粒倒入纯化柱后无需等待，应直接进行离心。在倒弃收集管内的液体后，保留收集管以备后续使用。这一步骤及后续步骤需在12,000-14,000rpm下离心2分钟，如离心机速度较低，需适当加长离心时间，确保液体完全穿透纯化柱。如有少量漂浮物，可再一次离心，或使用折叠的擦镜纸自制漏斗进行过滤。

在纯化柱内加入12毫升溶液IV，进行12,000-14,000rpm离心2分钟，以洗去杂质，并弃掉收集管内液体。添加溶液IV后可直接离心，无需等待。再进行一次12,000-14,000rpm离心2分钟，以去除残留液体并确保乙醇完全挥发。重要提示：倒弃收集管内液体后进行离心，以确保彻底去除微量的溶液IV，因为它可能会影响质粒的质量。

随后，将质粒纯化柱放置于50毫升离心管上，加入2毫升溶液V至管内柱面，静置2分钟。可用重蒸水或MilliQ级纯水替代溶液V，但水的pH值应不低于6.5。让溶液V在管内静置的时间稍长，有助于提高质粒的产量。若希望获得较高浓度的质粒，推荐使用1毫升溶液V进行洗脱，尽管这可能会使得质粒得率实测减少约5-10%，具体减少量因样品而异。

接着，进行12,000-14,000rpm离心2分钟，您将获得转细胞级超纯质粒。通常情况下，所得质粒浓度在0.1-0.3 mg/ml左右，适合用于细胞转染。如需更高浓度的质粒，可以采用异丙醇沉淀法或常规的乙醇沉淀法进行浓缩。

例如，可加入0.7倍体积的常温异丙醇（如1毫升待浓缩质粒中加入0.7毫升异丙醇），混匀后以12,000-14,000rpm在4°C下离心10分钟，小心吸去上清液，避免触碰沉淀。若希望获得更高浓度质粒，推荐在洗脱时使用1毫升洗脱液，然后转移至2毫升离心管中进行异丙醇沉淀，操作相对方便。异丙醇沉淀的DNA呈玻璃状近透明，很难与乙醇沉淀区分。

离心后要尽量轻柔提取离心管，避免沉淀松动或颗粒悬浮于液体中。不推荐直接倒弃上清，直接倒弃时常出现将质粒沉淀一并倒掉的情况；若仍需直接倒弃上清，建议先将其倒入干净的离心管中，以便回收可能的沉淀。建议使用移液枪吸取上清，并尽量避免吸走沉淀。

最后，加入1毫升常温70%乙醇溶液，轻轻悬起质粒沉淀以进行充分洗涤，然後以12,000-14,000rpm在4℃下离心5-10分钟，小心吸去上清液，避免接触沉淀。接着以5000-10,000rpm在4℃下离心5-10秒，用20微升或200微升移液器小心吸净残留液体，避免接触沉淀。观察肉眼无明显液体后（在吸净后通常1分钟内即可完成干燥），加入适量溶液（如溶液V、10 mM Tris-Cl pH 8.5或Milli-Q级纯水）溶解DNA。请注意，DNA样品不可过于干燥，否则不易溶解。在弱碱性条件下溶解DNA效果最佳，并在溶解过程中可用缓冲液反复冲洗管壁，以确保管壁上的DNA充分溶解。

本过程的轮廓中涉及的所有步骤和技巧，代表了高效质粒提取的标准流程。若您需要进一步的专业支持或产品，建议访问尊龙凯时以获取更多信息。我们的目标是助力您的生物医疗研究之旅，确保实验材料的高质量和可靠性。